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La transferencia incompleta de proteínas en wb? gorras te pueden ayudar! 2018-11-16 17:57:01

Siempre encontramos varios problemas en Western Blot (wb):
  • ¿Transferencia incompleta de proteínas?
  • alto fondo?
  • no hay bandas positivas?

......

A continuación, daremos las soluciones correspondientes a las posibles razones del problema de la transferencia insuficiente de proteínas y esperamos que pueda ayudarlo a tener éxito en el experimento.



1. ¿Por qué se necesita la transferencia de proteínas?


Western Blot es un método en el que las proteínas se transfieren a una membrana y luego se detectan utilizando un anticuerpo. para proteínas de expresión conocidas, el anticuerpo correspondiente se puede usar como un anticuerpo primario para la detección, y el producto de expresión del nuevo gen se puede detectar por la porción de fusión del anticuerpo.


la muestra de proteína separada por página se transfiere a un portador de fase sólida (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa), y el portador de fase sólida adsorbe la proteína con un enlace no covalente, y puede mantener el tipo de polipéptido y su actividad biológica. la proteína o el polipéptido en el portador de fase sólida se utiliza como antígeno, y el anticuerpo correspondiente es inmunoreactivo, y luego reacciona con la enzima o el anticuerpo secundario marcado con isótopos, y la proteína expresada por un gen específico se detecta mediante el desarrollo del color del sustrato autorradiografía.


2. La razón y solución de la transferencia incompleta.


razones
soluciones
la película no está completamente empapada
utilizar 100% de membrana permeable al metanol
El peso molecular de la proteína diana es inferior a 10.000
Seleccione una membrana de tamaño de poro pequeño para acortar el tiempo de transferencia
el punto isoeléctrico de la proteína objetivo es igual o cercano al ph del búfer de transferencia
intenta usar otros buffers comoácido n-ciclohexil-3-aminopropanosulfónico(caps) buffer (ph 10.5) o usando buffers de bajo ph como el buffer de acetato
la concentración de metanol es demasiado alta
la concentración excesiva de metanol hace que la proteína se separe de la sds, precipitando así en el gel, mientras que hace que el gel se contraiga o endurezca, inhibiendo así la transferencia de proteínas de alto peso molecular. reducir la concentración de metanol o usar etanol o isopropanol en su lugar
tiempo de transferencia insuficiente
Tiempo de transferencia extendido para geles espesos y proteínas de alto peso molecular


3. método de preparación paratapas (cas 1135-40-6) buffer


Consulte la siguiente tabla (ambas concentraciones de tampón e hidróxido de sodio son 0.1 mol / l):


ph de caps buffer
volumen (caps)
volumen (naoh)
6.8
250
0
10.0
218.3
31.7
10.5
178.6
71.4
10.8
156.3
93.7
11.2
138.9
111.1

La operación específica de la preparación es: 0.1 mol / l.tapasLa solución tampón se prepara primero en un matraz volumétrico. durante el proceso de configuración, el tampón debe deshidratarse a alta temperatura y enfriarse en un desecador; La solución de hidróxido de sodio 0,1 mol / l también se formula al mismo tiempo. De acuerdo con la fórmula en la tabla anterior, se puede preparar una solución tampón correspondiente a ph, y el hidróxido de sodio se utiliza principalmente para ajustar el ph.


Western Blot puede aplicarse para detectar proteínas diana de mezclas de proteínas, determinar cuantitativa o cualitativamente la expresión de proteínas en células o tejidos, y el posterior análisis de proteínas-proteína, proteína-dna y proteína-rna interacciones. La transferencia de películas es la base de wb, y su calidad es la clave del éxito de wb. Esperamos que los métodos anteriores puedan ayudarlo a tener éxito en el proceso de transformación.



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