con el desarrollo de la tecnología de recombinación genética, cada vez se pueden expresar más proteínas en células hospedadoras exógenas. sin embargo, en el proceso de expresión, el plegamiento incorrecto conduce a la agregación de proteína para formar un cuerpo de inclusión. por un lado, podemos evitar la formación de cuerpos de inclusión cambiando las condiciones de cultivo de las células aguas arriba, tales como la reducción de la temperatura de expresión, la reducción del tiempo de cultivo y la disminución de la concentración del inductor iptg. sin embargo, si la situación no puede cambiarse, el cuerpo de inclusión debe purificarse. yclorhidrato de guanidinajuega un papel muy importante en la purificación del cuerpo de inclusión.

(1) rompiendo células

las bacterias se recogieron para la centrifugación para obtener cuerpos de inclusión brutos.

(2) lavado de cuerpos de inclusión

los cuerpos de inclusión se lavan con un tampón que contiene baja concentración de desnaturalizante (tal como urea 2m) o sin agente desnaturalizante, para eliminar una parte de la heteroproteína, y el cuerpo de inclusión purificado se obtiene mediante centrifugación.

(3) disolución de cuerpos de inclusión

los cuerpos de inclusión purificados se solubilizan usando tampón que contiene una alta concentración de desnaturalizante, tal como 8 m de urea o 6 m de hidrocloruro de guanidina.

urea o hidrocloruro de guanidina (cas 50-01-1) tienen diferentes habilidades para disolver cuerpos de inclusión. la urea y el hidrocloruro de guanidina son agentes desnaturalizantes de intensidad moderada, que tienen fuertes efectos de desnaturalización reversible sobre el enlace de hidrógeno de los cuerpos de inclusión, pero la capacidad de la urea es más lenta y más débil que la del clorhidrato de guanidina. la concentración requerida de urea es generalmente de 8 m, que tiene un efecto de disolución pobre en aproximadamente un tercio de los cuerpos de inclusión de proteínas, y la solubilidad es del 70% ~ 90%; mientras que la concentración de hidrocloruro de guanidina es generalmente de 6 m, y puede disolver la mayoría de los cuerpos de inclusión, la capacidad de disolución es superior al 95%.

(4) renaturalización y purificación

los cuerpos de inclusión disueltos se pueden renaturalizar por dilución o diálisis antes de purificarse; o purificado y luego renaturalizado. alternativamente, la proteína del cuerpo de inclusión disuelta se somete a replegamiento en columna para lograr renaturalización y purificación simultáneamente. en general, el tamiz molecular (sec), la cromatografía de quelato de iones metálicos (ni2 +), el intercambio iónico (iex) y el hidrofóbico (hic) pueden tolerar altas concentraciones de desnaturalizante, por lo que pueden usarse diferentes técnicas cromatográficas para el replegamiento en columna. sin embargo, es necesario prestar atención a si la alta concentración del desnaturalizante u otros componentes en el tampón afectará la interacción entre la proteína y el relleno.

(5) detección y análisis

finalmente, la muestra obtenida se somete a detección y análisis para ver si se obtiene una proteína natural. los métodos generales de detección incluyen detección de actividad biológica, dicroísmo circular, dispersión de luz dinámica o filtración en gel, cromatografía de fase inversa, etc.

la renaturalización del cuerpo de inclusión es un proceso muy complicado y está sujeto a muchos factores. la concentración de varios reactivos y proteínas en el experimento, la temperatura de funcionamiento y el tiempo de renaturalización, la composición del tampón y el valor de pH son cruciales para los resultados experimentales. aunque el hidrocloruro de guanidina tiene deficiencias de alto costo, precipitación en condiciones ácidas, interferencia con la cromatografía de intercambio iónico de proteínas después de la renaturalización en el proceso de disolución de los cuerpos de inclusión, su solubilidad es fuerte y no causa la modificación covalente de la proteína recombinante.