El rápido desarrollo de la proteómica en los últimos años nos ha llevado a una comprensión más profunda de la función de las proteínas y los mecanismos de interacción. La clave para el estudio de la proteómica es la extracción de proteínas. Este trabajo introducirá la extracción de proteína total de células adherentes, células suspendidas y tejidos.

Extracción de proteína total (tf) de células adherentes

Preparación de lisado (pH 8,5-9,0): tris-hcl de 50 mm, eda de 2 mm, 100 ml de nacl, 0,5% de tritón x-100, ajustar el valor de pH a 8,5-9,0; Añadir 100 μg / ml de lisozima, 1 μl / ml de inhibidor de la proteasa pmsf en la solución.

Sin tratamiento de drogas:

(1) desechar el medio de cultivo con cuidado y poner la botella boca abajo sobre el papel absorbente para absorber el medio de cultivo;

(2) las células se lavaron con 3 ml de pb pre-enfriado (0,01 m ph 7,2 a 7,3), y los lavados se desecharon, se repitieron tres veces y luego se colocó el matraz sobre hielo;

(3) adición de solución de lisis, lisis en hielo durante 30 min;

(4) se rasparon las células a un lado del matraz con un rascador limpio y después se retiraron al tubo de centrifugación con una pipeta;

(5) centrifugación durante 5 minutos a 4ºC y 12.000 rpm;

(6) el sobrenadante se transfirió al tubo de centrifugación y se almacenó a -20ºC.

Con el tratamiento de drogas:

Debido al efecto de los fármacos, algunas células se caerían en la solución, por lo que las células en el medio de cultivo también se deben recoger además de la operación anterior:

(1) verter el medio de cultivo en el tubo de centrifugación, centrifugar durante 5 min a 2500 rpm;

(2) desechar el sobrenadante, añadir una cierta cantidad de pbs y soplar suavemente para lavarla con una pipeta, y luego centrifugar durante 5 min, repetir una vez;

(3) desechar el sobrenadante, añadir solución de lisis y ponerla sobre el hielo durante 30 min;

(4) mezclado con el lisado anterior, centrifugado durante 5 min a 4 ℃ y 12.000 rpm, tomar el sobrenadante en el tubo de centrífuga y almacenado a -20 ℃.

Extracción de proteína total de células en suspensión

(1) las células en suspensión se precipitaron, se centrifugaron a 2500 rpm durante 10 min, y el sobrenadante se descartó;

(2) añadir un reactivo de extracción de proteína precool que contiene un inhibidor;

(3) agitar durante 15 minutos suavemente;

(4) centrifugación a 14.000 rpm durante 15 min, desechar el precipitado y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga inmediatamente.

Extracción de proteína total en tejidos

(1) se coloca una pequeña cantidad de tejido en un homogeneizador de 1 ~ 2 ml, se corta el tejido en pedazos lo más pequeño posible;

(2) a~nadir 400 μl de solución de lisis detergente individual en el homogeneizador, homogeneizado, baño de hielo;

(3) hacer que la organización sea lo más rota posible;

(4) durante 30 minutos, el lisado se transfirió a un tubo de centrífuga, se centrifugó a 12000 rpm y 4ºC durante 5 min, y el sobrenadante se almacenó en el tubo de centrifugación a -20ºC.

La extracción de la muestra de proteínas es un requisito previo para el análisis posterior. El método ideal de separación de proteínas debe incluir todas las proteínas, tanto como sea posible, no contaminantes y el post-procesamiento es simplificado. Sistema diferente, método diferente, por lo que debemos elegir el método apropiado para obtener los mejores resultados de análisis.

Editado por suzhou yacoo science co., Ltd.