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¿Qué ingredientes son necesarios para la purificación de proteínas?

2017-11-07 14:09:45


las proteínas están típicamente presentes en mezclas complejas en tejidos o células y, por lo tanto, requieren purificación en muchas aplicaciones experimentales tales como estudios estructurales y ensayos bioquímicos in vitro. La purificación de proteínas se basa en sus diferentes propiedades físicas para separarse de las materias primas a fin de lograr el propósito de obtener las proteínas más funcionales. entre ellos, la solución purificada de proteína ha desempeñado un papel crucial, entonces, ¿qué ingredientes se necesitan en la solución?


sistema de buffer


las proteínas deben mantenerse en un buen entorno de amortiguación para evitar efectos irreversibles en el estado de plegamiento de proteínas, la solubilidad y la actividad. los experimentos bioquímicos comúnmente usan un valor de pH de 7,4, pero en los experimentos de purificación de proteínas, también se debe considerar el punto isoeléctrico de la proteína. en el punto isoeléctrico, las moléculas de proteína existen en forma de zwitteriones con cargas positivas y negativas iguales y carga neta cero. sus partículas pueden colisionar fácilmente y agregarse para formar precipitados. por lo tanto, el ph debe establecerse de acuerdo con el punto isoeléctrico de la proteína. un buen buffer debe tener las siguientes características:


Agua soluble;
estabilidad química;
buena capacidad de almacenamiento intermedio en el rango de ph requerido;
buena compatibilidad con las condiciones de aplicación analítica y experimental;

buena compatibilidad con otros solutos.


sistema de búfer común se muestran en la siguiente tabla:

sistema de buffer
ph ventajas
desventajas
tris
7.5 ~ 9.0
el proceso de preparación es simple; poco interfiere con el sistema
ph cambia con la temperatura o la dilución
ácido fosfórico
5.8 ~ 8.0
ph no cambia con la temperatura
más fácil de formar precipitados con ca2 +, mg2 + y iones de metales pesados ​​comunes; inhibir ciertos procesos bioquímicos y la mayoría de las actividades enzimáticas
fregonas
6.5 ~ 7.9
alta capacidad de almacenamiento en buffer en ph fisiológico distancia
no puede ser esterilizado en autoclave; el ph cambia en cierta medida con la temperatura
Hepes
6.8 ~ 8.2
alta solubilidad, no afecta la reacción química, poco impacto ambiental
no puede ser esterilizado en autoclave; ph cambia en cierta medida con la temperatura; generará radicales libres bajo ciertas condiciones


agente reductor


si la proteína contiene residuos de cisteína, la oxidación entre residuos de cisteína puede provocar la agregación de proteínas. en este caso, a menudo es necesario agregar un agente reductor al buffer. los agentes reductores comúnmente usados ​​son β-mercaptoetanol (bme), ditiotreitol (dtt) y clorhidrato de tris- (2-formil etil) fosfina (tcep-hcl). bme contiene un grupo mercapto, que tiene la peor reducibilidad y solo puede mantener de 2 a 3 días. dtt tiene dos grupos mercapto, que es más fuerte que bme durante 3 ~ 7 días. la capacidad de reducción de tcep es más fuerte que la de bme y dtt, su función se puede mantener durante 2 ~ 3 semanas. tcep no solo tiene una fuerte capacidad de reducción, alta selectividad, sino también más estable tanto en condiciones ácidas como alcalinas.


inhibidor de proteasa


inhibidores de proteasa en un sentido amplio, se refiere a los materiales que se pueden combinar con el sitio activo de las moléculas de proteasa, de modo que la actividad de la proteasa disminuye o incluso desaparece, pero no para desnaturalizar la proteína de la enzima. a menudo se agrega en las primeras etapas del tampón de lisis y el proceso de purificación para evitar la enzimólisis de la proteína diana mediante proteasas endógenas. inhibidores de proteasa comunes son:


inhibidores de leupeptina-serina y cisteína proteasa;

inhibidor de proteasa aspártico e polipéptido inhibidor gástrico;

inhibidores de la proteasa pmsf-serina


hay otros aditivos, tales como el quelante de metales edta o egta, que puede quelar ca2 + o mg2 + para evitar que la proteína diana se degrade por la metaloproteasa; arginina quinasas que estabilizan la estructura de la proteína y aumentan la solubilidad; estabilizadores iónicos, mejorar la solubilidad, y así sucesivamente.


La separación y purificación de proteínas es un trabajo complejo e importante, que impacta directamente en el éxito de los experimentos posteriores. sin embargo, no existe un solo método o un conjunto de métodos listos para extraer cualquier proteína de una mezcla compleja, por lo que en la práctica también es necesario que el investigador explore las condiciones para elegir la forma más adecuada de obtener productos de alta pureza .


editado por suzhou yacoo science co., ltd.

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